本方法建立了一种同时检测猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 野毒株、猪A群轮状病毒 (GARV)、猪德尔塔冠状病毒 (PDCoV)、猪阿尔法冠状病毒 (SADS-CoV) 及猪捷申病毒 (PTV) 的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测法。该方法对 PEDV 多个基因型毒株ORF3基因比对分析，以PEDV野毒株为模板，对疫苗株基因稳定缺失区设计特异性探针，并在两端保守区域设计上下游引物；在靠近GARV G3、G4、G5和G9型 NSP5基因5′端保守区设计引物及探针。同时，分别选择PDCoV M基因、PTV 5′UTR序列、SADS-CoV N基因等保守基因设计特异性引物及探针，用于多重荧光定量PCR方法的建立。对引物、探针浓度和退火温度进行优化；用RStudio参照代码绘制ROC曲线，确定检测方法的敏感度值、特异度值及曲线下面积AUC，并计算Youden指数，最终确定检测临界值；从阳性核酸中扩增靶基因，并克隆至pEASY-T1载体。通过体外转录，获得五种标准品分别命名为：cRNA-PEDV、cRNA-GARV、cRNA-PDCoV、cRNA-PTV和cRNA-SADS-CoV。对检测方法的敏感性、特异性和重复性等进行评估；并与同类方法对临床样本的检测符合率进行比较。最终，得到了5种病原检测的最佳引物、探针浓度和最佳退火温度。根据ROC曲线确定PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV临界CT值分别为：35.78、34.25、34.98、34.60和35.11；五种病原的检测下限均可达到1×10² coplies/µL，标准曲线线性关系良好，扩增效率在96.3%~104%之间；该方法对等多种菌毒株均不检出，具有良好的特异性；经重复性检验，组内变异系数在0.22%~3.08%之间，组间变异系数在0.89%~4.0%之间。对300份临床样本检测并与同类方法的检测结果进行比较，符合率较高，Kappa值均大于0.9。对PEDV野毒株的检测准确性高于同类方法。本方法为猪腹泻病的快速鉴别诊断和流行病学调查提供了一种高效灵敏的工具。

检测五种猪腹泻病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR的建立及应用

3.1 主要的菌毒株

本研究所用菌毒株主要用于方法建立过程中的基因扩增，反应条件优化及特异性检验，主要包括：PEDV疫苗株和野毒株、GARV 3个基因型核酸、PDCoV、PTV 2个基因型核酸、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)、猪瘟病毒 (CSFV)、猪伪狂犬病毒 (PRV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 (PRRSV)、猪霍乱沙门氏菌 (S.choleraesuis)、猪源巴氏杆菌 (P.multocida)、猪源大肠杆菌 (E.coli)、猪链球菌 (S.suis) 和葡萄球菌 (S.aureus)等均由西南民族大学动物医学实验室保存 

3.2 主要试剂

KOD One^TM PCR Master Mix购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit、Plasmid Mini kit质粒小量提取提取试剂盒购自美国OMEGA生物技术公司；Trizol核酸提取试剂、In vitro Transcription T7 Kit (for siRNA Synthesis) 和One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit (Perfect Real Time) 购自TaKaRa公司；pEASY®-Blunt Cloning Kit、Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；SADS-CoV N基因 (登录号: MK651076.1) 克隆载体 (pUC57-SADS-CoV) 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

3.3 样本来源及处理

本研究所用临床样本采自四川省阿坝州腹泻猪肛门棉拭子样本共300份。采集实验级巴马小型猪肛门棉拭子用PEDV、TGEV、PoRV快速实时荧光RT-PCR检测试剂盒及参考文献报道的Taqman探针荧光检测法分别对PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV进行检测，获得90份真阴性样本。所有样本按1:3 (v/v) 加入无菌 PBS，低温保存送样至实验室。后经震荡混匀，反复冻融3次，离心取上清，用Trizol法提取总核酸，存于-80℃冰箱备用。

3.4 探针、引物的设计与合成

使用Megalign将GenBank中已登录的包括PEDV四种基因亚型共24个野毒株和减毒疫苗株的ORF3基因进行比对分析发现，弱毒疫苗株ORF3基因244~295位均存在50~51bp碱基缺失。根据这一特征，本研究以该区域为靶点设计特异性探针，使其仅针对PEDV野毒株进行检测 (见表1)。

对GARV引物及探针设计时，首先对已登录的4种G型GARV NSP5基因序列比较，发现靠近5′端约290个碱基同源性可达 96.3%~100%，是所有基因节段中最为保守的区域；以NSP5基因为靶点，根据其保守区域设计引物及探针。

此外，对PDCoV M基因、PTV 5′UTR序列、SADS-CoV N基因的保守区域分别设计特异性引物及探针，用于多重荧光定量PCR方法的建立，详细信息见表1。同时，本研究分别对上述靶基因全基因序列进行扩增，用于cRNA标准品的构建，详细信息见表2。所有引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV靶基因扩增引物

表2 荧光定量RT-PCR引物和探针

3.5 标准品的制备

将PEDV、GARV、PDCoV、PTV阳性核酸和 pUC57-SADS-CoV 用靶基因扩增引物扩增。回收纯化扩增产物并连接至pEASY®-Blunt Cloning Kit，转化Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞。筛选阳性克隆菌提取质粒，送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司进行测序。

将GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV阳性质粒用限制性内切酶Sal Ⅰ、PEDV用限制性内切酶BamH Ⅰ线性化处理后，用DNA纯化试剂盒纯化回收，用In vitro Transcription T7 Kit 试剂盒进行体外转录，反应体系为：10×Transcripition Buffer 2µL、4种dNTP Solution各2µL、RNase Inhibitor 0.5µL、T7RNA Polymerase 2µL、RNase free dH₂O 1.5µL、linear template DNA 6µL；反应程序为：42℃，2h。反应结束后，加5µL RNase free DNaseⅠ，37℃ 30min，用Trizol法纯化cRNA。将标准品分别命名为：cRNA-PEDV、cRNA-GARV、cRNA-PDCoV、cRNA-PTV和cRNA-SADS-CoV。用NanoDorp2000 测定cRNA浓度，用RNase free dH₂O将cRNA浓度统一调整到510⁸coplies/µL并等体积混匀备用，稀释后各标准品浓度为110⁸coplies/µL。

3.6 一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR反应体系及条件的优化

用五种病毒cRNA标准品作为模板，分别对各引物浓度 (0.04~4 µmol/L)、探针浓度(0.04~4 µmol/L)、退火温度 (50℃~60℃) 进行优化。反应程序为：42℃ 5min，95℃ 10s；95℃ 5s，退火 30s，采集荧光信号，40个循环。

3.7 检测临界值的初步确定

将每种病毒cRNA等量混合并稀释到10¹、10²、10³拷贝各30份，再分别与真阴性样本总RNA按1:1(v/v) 等体积混合，作为真阳性样本。分别用本研究建立的多重荧光定量PCR方法对真阴性样本及cRNA真阳性样本进行检测，用RStudio参照代码绘制ROC曲线 (Receiver operating characteristic curve，ROC曲线)，确定检测方法的敏感度值(Sensitivity, Se值)、特异度值(Specificity, Sp值)及曲线下面积AUC，并计算Youden指数(Youden index) ()。Youden指数较大值所对应的数值为检测临界值。

3.8 标准曲线的建立

将各病毒cRNA标准品等体积混合后，进行10¹~10⁸稀释，并进行一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR反应，以拷贝数的对数为横坐标，CT值为纵坐标，建立标准曲线，计算扩增效率。

3.9 敏感性测试

cRNA标准品混合物10倍倍比稀释，进行一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR反应，评价该方法的灵敏性。

3.10 特异性检验

用多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法对PEDV (SCXM株、SWUN-D1株、SWUN-D2株、CV777疫苗株、AJ1102疫苗株)、GARV(G3、G5、G9型)、PDCoV、PTV(3、6型)、cRNA-SADS-CoV、TGEV、CSFV、PRV、PRRSV、S.choleraesuis、P.multocida、E.coli、S.suis和S.aureus等13种猪常见的细菌病毒进行检测，用真阴性核酸作阴性对照，无菌水为空白对照，进行特异性检验。

3.11 重复性试验

分别用10²、10⁴、10⁶拷贝的cRNA标准品混合物稀释液，在第1、7、30天分别进行3次重复试验，计算组内和组间变异系数，评价方法的重复性。

3.12 临床样本检测

用本研究建立的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR法对采自年四川省阿坝州的300份肛门棉拭子样本进行检测。同时，用商品化试剂盒及参考文献报道的同类方法再次检测临床样本进行复核，比较不同方法的检测效果和符合率。

3.13 结果

3.13.1 最佳反应条件

分别对引物、探针浓度及退火温度进行优化，获得最佳反应体系为：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 25 µL，TaKaRa Ex Taq HS 1 µL，PrimeScripe RT Enzyme Mix Ⅱ 1 µL，PEDV (引物0.56µmol/L，探针0.36 µmol/L)，GARV (引物0.2 µmol/L，探针0.1 µmol/L)，PDCoV (引物0.2µmol/L，探针0.32µmol/L)，PTV (引物0.32 µmol/L，探针0.12 µmol/L)，SADS-CoV (引物0.36 µmol/L，探针0.12 µmol/L)，Total RNA 7.5µL，RNase Free dH₂O 3.3µL；最佳退火温度58℃。

3.13.2 检测临界值

    结果显示，本方法对PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV的CT临界值分别为：35.78 (se值0.93、sp值0.87、Youden指数0.8)、34.25 (se值0.78、sp值0.84、Youden指数0.62)、34.98 (se值0.80、sp值0.95、Youden指数0.75)、34.60 (se值0.92、sp值0.7、Youden指数0.62)、35.11 (se值0.88、sp值为0.74、Youden指数0.62)。AUC值均大于0.8，表明检测准确性良好。

3.13.3 标准曲线的建立

五种猪腹泻病毒的标准曲线见图1结果显示，各组拷贝数与CT值有良好的线性关系，扩增效率较高：PEDV(R² = 0.9901，E=104%)，GARV(R² = 0.9976，E=102%)，PDCoV(R² = 0.9961，E=102%)，PTV(R² = 0.9984，E=98.7%)，SADS-CoV(R² = 0.9993，E=96.3%)。

(a) PEDV；(b) GARV；(c) PDCoV；(d) PTV；(e) SADS-CoV

图1 一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR标准曲线

3.13.4 敏感性试验

根据敏感性测试结果并结合检测临界值判定，PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV最低检测限均可达到110²coplies/µL；其中，对SADS-CoV检测时，110¹coplies/µL样本对应CT值为37.42，但通过ROC曲线确定的临界CT值为35.11，表明该方法无法检测到110¹coplies/µL的SADS-CoV cRNA。

表3一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR敏感性

(a) PEDV; (b) GARV; (c) PDCoV; (d) PTV; (e) SADS-CoV

图2步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR敏感性试验结果

3.13.5 重复性试验

重复性试验结果如表4所示，PEDV组内变异系数为1.06%~2.64%，组间变异系数为0.47%~2.07%；GARV组内变异系数为0.22%~2.31%，组间变异系数为0.89%-1.99%； PDCoV组内变异系数为1.95%~2.46%，组间变异系数为1.03%~4.0%；PTV组内变异系数为0.42%~1.76%，组间变异系数为0.91%~3.80%；SADS-CoV组内变异系数为1.16%~3.08%，组间变异系数为0.77%~1.78%。以上数据表明，一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR具有良好的稳定性及重复性。

表4一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR重复性CT值分析

3.13.6 特异性试验

特异性试验结果显示，该方法只检出PEDV野毒株、GARV(G3、G5、G9型)、PDCoV、PTV(3、6型)、cRNA-SADS-CoV，对PEDV弱毒疫苗株及其他猪常见病原均无非特异性扩增曲线，结果表明该方法特异性良好。

3.13.7 临床样本检测

用本研究建立的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR法对阿坝州300份腹泻猪样本进行检测。同时用商品化荧光定量试剂盒及文献报道方法与本方法进行检测符合率比较。结果显示，对 PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV符合率分别为：98.6% (k=0.92)、97.6% (k=0.91)、100% (k=1)、98.9% (k=0.93) 和100% (k=1) 。其中，商品化试剂盒比本研究建立方法，多检出5份PEDV阳性样本，漏检3份GARV阳性样本和4份PTV阳性样本。我们进一步对上述样本中，PEDV ORF3基因、GARV NSP5基因和PTV 5′ UTR序列分别进行了普通PCR扩增和测序分析。结果显示，本方法未检出的5个PEDV ORF3基因与CV777 弱毒株基因序列同源性均高于99%，且存在碱基缺失，表明样本中存在PEDV疫苗毒且对试剂盒检测结果造成了干扰。对GARV NSP5基因和PTV 5′ UTR的测序结果经BLAST分析表明，与GenBank中登录序列同源性均高于97%。表明本研究建立的一步法多重荧光定量检测法对GARV和PTV的检测灵敏度更高。

此外，根据本次调查，在四川省阿坝州均无SADS-CoV检出；但PEDV、GARV、PDCoV和PTV群体阳性率分别：60%(3/5)、60%(3/5)、80%(4/5)和60%(3/5)，总体阳性率分别为：11.7%(35/300)、14%(42/300)、10.7%(32/300)和7%(21/300) (表7)。此外，PEDV和GARV混合感染率为1.67% (5/300)，PEDV和PDCoV混合感染率为4% (12/300)，PEDV、GARV和PDCoV混合感染率为1% (3/300)。上述结果表明，目前PEDV、GARV、PDCoV和PTV在四川阿坝州地区腹泻猪群中仍广泛存在，且还出现不同程度的混合感染，加剧猪腹泻发病率和死亡率，需要进一步对本地区猪腹泻病原感染情况和遗传变异特征进行调查，制定更具针对性的防控措施。