为建立一种伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和绿脓杆菌四种病原的联合共检方法，以伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和绿脓杆菌基因序列为模板，克隆得Cory-PLD基因、Stap-NUC基因、Arc-PLO基因和Pse-OPRI基因序列并构建四种病原核酸标准品，设计四对探针，构建伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和绿脓杆菌四重TaqMan荧光定量PCR方法，然后对方法检测条件进行优化及质量评价，并作临床初步验证。结果显示，构建的伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和绿脓杆菌四重TaqMan荧光定量PCR方法特异性好，伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和绿脓杆菌检测最低拷贝数分别为3.54×10¹、5.57×10¹、3.24×10¹、7.96×10¹ copies/μL；稳定性好，且与病原学检测相比具有较高的检测符合率；对52份临床样本作检测，伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和绿脓杆菌的阳性检出率分别为32.7%、51.9%、19.2%和0，金黄色葡萄球菌和化脓隐秘杆菌混合感染率为3.8%。本研究成功构建了伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和绿脓杆菌四重TaqMan荧光定量PCR检测方法，可为今后此四类疫病的防控提供了重要的参考依据。

随着我国牛羊产业集约化和规模程度的提高，牛羊类疾病的发病率逐年上升。干酪性淋巴结炎(caseous lymphadenitis ,CLA )是一种人兽共患慢性传染病，其中以的发病和危害最为广泛和严重，该病主要表现为患病动物皮下组织或浅表淋巴结肿大，化脓形成脓腔。虽然其致死率相对较低，但往往因未得到足够的重视而导致该病广泛传播且难以清除，严重影响牛羊的生产性能和皮张质量，给牛羊养殖业带来很大的经济损失。伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和绿脓杆菌是引起干酪性淋巴结炎的主要细菌性病原。由于此四种病原的发病表现要么近似，要么多发生混合感染，临床上常难以进行快速、较准确而有效的鉴别诊断。因此，建立一种既快速，相对更准确的联合共检方法，对于这类疫病快速诊检和有效防控具有十分重要的意义。

实时荧光定量PCR技术是常用的分子检测手段之一，将普通探针法荧光定量PCR与多通道荧光信号技术相结合后，可通过检测荧光信号强度直接对产物进行定性和定量分析。目前，牛羊干酪性淋巴结炎的诊断主要依靠病原菌的分离鉴定，但由于化脓隐秘杆菌、伪结核棒状杆菌培养条件要求苛刻，生长缓慢，易漏检，存在的多重PCR方法敏感性不高，病原检测不全面。而多重TaqMan荧光定量PCR检测方法具有操作简便、检测快速、结果敏感等优势，被广泛用于病原及其分型的检测中。本研究通过以牛羊干酪性淋巴结炎主要病原菌为基础，建立一种同时检测主要病原菌的多重TaqMan荧光定量PCR检测方法，并初步应用于生产中临床样品的检测，以期为牛羊生产中上述疫病的快速诊断和防控提供参考。

3.1 方法

3.1.1 Cory-PLD基因、Stap-NUC基因、Arc-PLO基因和Pse-OPRI基因的克隆鉴定

根据NCBI上已登录的伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和绿脓杆菌的基因序列比对分析后，Beacon Designer分别对伪结核棒状杆菌的PLD基因、金黄色葡萄球菌的NUC基因、化脓隐秘杆菌的PLO基因、绿脓杆菌的OPRI基因设计引物及探针（表1）。提取伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和绿脓杆菌的DNA，以-DNA为模板扩增目的基因，将胶回收产物连接pMD19-T Simple载体并转化，阳性的重组质粒送上海生工生物工程有限公司测序后保存。

表1  多重TaqMan荧光定量PCR的引物及探针信息

3.1.2四重TaqMan荧光定量PCR扩增及反应条件的优化

使用设计的引物和探针以及构建的Cory-PLD、Stap-NUC、Arc-PLO和Pse-OPRI质粒标准品为模板进行PCR反应，反应体系见表2。qPCR反应条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 min，共35个循环，72 ℃再延伸10 min。在与上述TaqMan多重PCR反应相同的条件下，引物浓度（10μmol/L）在（0.2~2）μL区间，探针浓度（10 μmol/L）在（0.2~2）μL区间，退火温度在55～62℃对其反应条件进行优化。

表2  TaqMan多重定量PCR扩增反应体系

3.1.3 四重TaqMan荧光定量PCR标准曲线的建立

用稀释至10¹~10⁸ copies/μL的标准质粒为模板进行PCR扩增，根据标准品起始拷贝数的对数和四种病原各个稀释度Ct值之间的线性关系绘制标准曲线。

3.1.4 四重TaqMan荧光定量PCR检测方法的质量评价

将伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和绿脓杆菌的质粒标准品按照两两随机分组等量混合，以上述分组混合液、牛副流感病毒3型等菌毒株核酸及无菌水为模板进行反应，评价特异性。同时，用NanoDrop one 微量分光光度计测定伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和绿脓杆菌核酸标准品浓度，将其倍比稀释至10¹ ~10⁹ copies/μL，以各个浓度的稀释液为模板进行反应，评价灵敏性。将稀释好的质粒标准品分别取10³、10⁵、10⁷浓度，在每个浓度下设置3个平行对照，进行组间和组内平行试验，评价重复性。

3.1.5 临床样本的检测

将采集自四川省简阳、南江2县市及重庆大足3个羊场共52份临床样本，用已建立的方法检测。检测结果采用卡方检验检测样本百分数间的显著性差异，用SPSS 26.0软件进行统计学分析。

3.2结果

3.2.1 靶基因的克隆

成功扩增Cory-PLD、Stap-NUC、Arc-PLO和Pse-OPRI靶基因。对构建好的阳性质粒标准品进行PCR扩增，扩增的目的片段与预期大小一致（图1）。

M：DNA 标准DL 2 000 1：伪结核棒状杆菌; 3：金黄色葡萄球菌; 5：绿脓杆菌; 2、4、6：阴性对照

图1 阳性质粒 PCR 扩增结果

3.2.2 四重TaqMan荧光定量PCR方法反应条件的优化

结果显示，反应总体积 25 μL，伪结核棒状杆菌引物及探针浓度为 0.2 μmol/L；金黄色葡萄球菌引物浓度为 0.4 μmol/L，探针浓度为 0.6 μmol/L；化脓隐秘杆菌引物及探针浓度为 0.4 μmol/L；绿脓杆菌引物及探针浓度为 0.7 μmol/L，标准品混合物为 4 μL，退火温度为60℃，扩增效果最佳（图2）。

图2  四重TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件的优化

3.2.3 三重TaqMan荧光定量PCR标准曲线的建立

结果显示，绘制的标准曲线呈良好的线性关系，与预期结果相符合（图3）。

图3 四重TaqMan荧光定量RT-PCR标准曲线

3.2.4 四重TaqMan荧光定量PCR方法的质量评价

结果显示，构建的方法对牛副流感病毒3型等菌毒株均无扩增，即该方法特异性好（图4）。伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和绿脓杆菌检测的最低拷贝数分别为3.54×10¹、5.57×10¹、3.24×10¹、7.96×10¹ copies/μL（图5）。组内与组间Ct值发现变异系数（CV）均小于4%，说明该方法稳定性良好。

图4  四重TaqMan荧光定量PCR特异性试验结果

a: Stap-NUC 10⁸～10¹倍梯度稀释; b: Cory-PLD 10⁹～10²倍梯度稀释; c: Arc-PLO 10⁹～10¹倍梯度稀释；Pse-OPRI 10⁸～10¹倍梯度稀释

图5  四重TaqMan荧光定量PCR敏感性试验结果

3.2.5 临床样本检测

伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和绿脓杆菌的阳性检出率分别为32.7%、51.9%、19.2%和0，金黄色葡萄球菌和化脓隐秘杆菌混合感染率为3.8%。

3.2.6结论

本研究构建了同时检测伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和绿脓杆菌的四重TaqMan荧光定量PCR方法，为今后防控此四类疫病提供了重要的依据。